เว็บสล็อต โปรตีน Cas9 (สีเทา) เป็นนิวคลีเอสที่มี RNA นำทางซึ่งสามารถตั้งโปรแกรมให้ผูกและตัดลำดับดีเอ็นเอที่ตรงกัน (เกลียวคู่สีน้ำเงินเข้ม) ทำให้เป็นเครื่องมืออันทรงพลังสำหรับวิศวกรรมจีโนม เมื่อจับเป้าหมาย โดเมนโปรตีน Cas9 ได้รับการจัดเรียงโครงสร้างใหม่ (การเคลื่อนที่ของกรดอะมิโนแต่ละตัวถูกแทนด้วยหางจรวด) เพื่อกระตุ้นสารเชิงซ้อน Cas9-sgRNA
สำหรับความแตกแยกของเป้าหมาย โดเมน REC3
(น้านเป็ด) มีหน้าที่ในการตรวจจับเป้าหมาย ซึ่งส่งสัญญาณการหมุนออกด้านนอกของโดเมน REC2 (สีม่วงแดง) เพื่อเปิดเส้นทางสำหรับโดเมนนิวคลีเอส HNH (สีเหลือง) โครงสร้างที่ออกฤทธิ์ของ Cas9 ต่อจากนั้นสามารถกระตุ้นการแตกแยกร่วมกันของสายทั้งสองของ DNA เป้าหมาย (กราฟิกเจเน็ต อิวาสะ)
นักวิทยาศาสตร์จากโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย เบิร์กลีย์ และแมสซาชูเซตส์ เจเนอรัล ได้ระบุส่วนสำคัญภายในโปรตีน Cas9 ที่ควบคุมความแม่นยำของ CRISPR-Cas9 ที่อยู่ในลำดับ DNA เป้าหมาย และปรับแต่งเพื่อผลิตตัวแก้ไขยีนที่มีความแม่นยำสูงด้วย ระดับต่ำสุดของการตัดนอกเป้าหมายจนถึงปัจจุบัน
โดเมนโปรตีนที่นักวิจัยระบุว่าเป็นผู้ควบคุมหลักของการตัด DNA เป็นเป้าหมายที่ชัดเจนสำหรับการปรับวิศวกรรมใหม่เพื่อปรับปรุงความแม่นยำให้ดียิ่งขึ้นไปอีก แนวทางนี้ควรช่วยให้นักวิทยาศาสตร์ปรับแต่งสายพันธุ์ของ Cas9 ซึ่งเป็นโปรตีนที่ผูกและตัด DNA เพื่อลดโอกาสที่ CRISPR-Cas9 จะแก้ไข DNA ผิดที่ ซึ่งเป็นข้อพิจารณาหลักในการบำบัดด้วยยีนในมนุษย์
กลยุทธ์หนึ่งเพื่อให้ได้ความแม่นยำที่ดีขึ้นคือการสร้างการกลายพันธุ์ในโดเมนโปรตีนที่ควบคุม เรียกว่า REC3 และดูว่าวิธีใดปรับปรุงความแม่นยำโดยไม่ส่งผลกระทบต่อประสิทธิภาพของการตัดตามเป้าหมาย
“เราพบว่าแม้แต่การเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในโดเมน REC3 ของ Cas9 ส่งผลกระทบต่อความแตกต่างระหว่างการแก้ไขในและนอกเป้าหมาย ซึ่งแสดงให้เห็นว่าโดเมนนี้เป็นตัวเลือกที่ชัดเจนสำหรับการทำให้เกิดการกลายพันธุ์ในเชิงลึกเพื่อปรับปรุงความจำเพาะของการกำหนดเป้าหมาย ในฐานะที่เป็นส่วนขยายของงานนี้ เราสามารถทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่เป็นกลางมากขึ้นภายใน REC3 มากกว่าการกลายพันธุ์ที่เป็นเป้าหมายที่เราทำ” เจนิซ เฉิน ผู้เขียนร่วมคนแรก นักศึกษาระดับบัณฑิตศึกษาในห้องปฏิบัติการของเจนนิเฟอร์ ดูดน่า ผู้ร่วมคิดค้น CRISPR- เครื่องมือแก้ไขยีน Cas9
ผู้เขียนร่วมคนแรก Chen, Yavuz Dagdas และ Benjamin Kleinstiver และเพื่อนร่วมงานของพวกเขาที่ UC Berkeley, Massachusetts General Hospital และ Harvard University รายงานผลของพวกเขาทางออนไลน์ในวันนี้ก่อนที่จะ ตีพิมพ์ในวารสาร Nature
Cas9 . แม่นยำสูง
ตั้งแต่ปี 2012 เมื่อ Doudna ศาสตราจารย์ด้านชีววิทยาระดับโมเลกุลและเซลล์และเคมี และผู้ตรวจสอบสถาบันการแพทย์ Howard Hughes ที่ UC Berkeley และเพื่อนร่วมงาน Emmanuelle Charpentier ที่ Max Planck Institute for Infection Biology ได้นำโปรตีน Cas9 กลับมาใช้ใหม่เพื่อสร้างโปรตีน Cas9 ราคาถูก แม่นยำ และ ตัวแก้ไขยีนที่ใช้งานง่าย นักวิจัยพยายามลดโอกาสในการแก้ไขนอกเป้าหมาย แม้ว่าความเที่ยงตรงที่ได้รับการปรับปรุงจะเป็นประโยชน์ต่อการวิจัยขั้นพื้นฐาน แต่สิ่งสำคัญอย่างยิ่งในการแก้ไขยีนสำหรับการใช้งานทางคลินิก เนื่องจากการตัด DNA นอกเป้าหมายใดๆ อาจทำให้ยีนที่สำคัญไม่ทำงานและนำไปสู่ผลข้างเคียงที่ไม่คาดคิดอย่างถาวร
ภายในสองปีที่ผ่านมา สองทีมออกแบบโปรตีน Cas9
ที่มีความแม่นยำสูง – ความจำเพาะที่เพิ่มขึ้นเรียกว่า eSpCas9 (1.1) และความแม่นยำสูงที่เรียกว่า SpCas9-HF1 – และ Chen และ Doudna พยายามที่จะเรียนรู้ว่าทำไมพวกเขาถึงตัดด้วยความจำเพาะที่สูงกว่าในป่า โปรตีน Cas9 จาก Streptococcus pyogenes ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในปัจจุบัน
ปัจจุบัน นักวิจัยที่ใช้ CRISPR-Cas9 ได้สร้าง RNA ไกด์เดี่ยว (sgRNA) ซึ่งเป็นโมเลกุล RNA ที่มีสายโซ่ของกรดไรโบนิวคลีอิก 20 ตัวที่เสริมลำดับดีเอ็นเอของกรดนิวคลีอิก 20 ตัวที่พวกเขาต้องการกำหนดเป้าหมาย และแนบเข้ากับ Cas9 คู่มือ RNA นี้ช่วยให้ Cas9 เข้าสู่ DNA เสริม ผูกกับมันและตัดเกลียวคู่ แต่สารเชิงซ้อน Cas9-sgRNA ยังสามารถจับกับ DNA ที่ไม่ตรงกันทุกประการ นำไปสู่การตัดออกนอกเป้าหมายที่ไม่ต้องการ
ในปี 2015 ห้องทดลองของ Doudna ได้ค้นพบ สวิตช์โครงสร้างของ Cas9 ที่เปิดใช้งานเมื่อคู่มือ RNA และเป้าหมายของ DNA ตรงกัน พวกเขาพบว่าเฉพาะเมื่อ RNA และ DNA จับคู่กันอย่างใกล้ชิดเท่านั้นโครงสร้าง 3 มิติของ Cas9 โดยเฉพาะอย่างยิ่งโครงสร้างของโดเมนนิวคลีเอส HNH จะเปลี่ยนและเปิดใช้งานกรรไกรของ Cas9 อย่างไรก็ตาม กระบวนการที่รับผิดชอบในการตรวจจับกรดนิวคลีอิกต้นน้ำของสวิตช์โครงสร้างยังไม่ทราบ
ในการศึกษาในปัจจุบัน Chen และ Dagdas ใช้เทคนิคที่เรียกว่า single-molecule FRET (Förster resonance energy transfer) เพื่อวัดอย่างแม่นยำว่าโดเมนโปรตีนต่างๆ ในคอมเพล็กซ์โปรตีน Cas9-sgRNA โดยเฉพาะอย่างยิ่ง REC3, REC2 และ HNH เคลื่อนที่อย่างไรเมื่อคอมเพล็กซ์ ผูกมัดกับดีเอ็นเอ
รักษาประสิทธิภาพในขณะที่เพิ่มความเที่ยงตรง
ในตอนแรกพวกเขาพิจารณาว่าผลประโยชน์จำเพาะที่ได้รับจาก eSpCas9(1.1) และ SpCas9-HF1 สามารถอธิบายได้ด้วยข้อเท็จจริงที่ว่าเกณฑ์สำหรับสวิตช์โครงสร้าง HNH นั้นสูงกว่าสำหรับตัวแปร Cas9 เหล่านี้มากเมื่อเทียบกับโปรตีน Cas9 ชนิดดั้งเดิม ทำให้ eSpCas9 (1.1) และตัวแปร SpCas9-HF1 มีโอกาสน้อยที่จะเปิดใช้งานกรรไกรเมื่อเชื่อมโยงกับลำดับนอกเป้าหมาย
จากนั้น พวกเขาได้เปิดเผยว่าโดเมน REC3 มีหน้าที่ในการตรวจจับความแม่นยำของการผูกเป้าหมาย ซึ่งจะส่งสัญญาณการหมุนออกด้านนอกของโดเมน REC2 เพื่อเปิดเส้นทางสำหรับโดเมน HNH nuclease ซึ่งกระตุ้นกรรไกร โครงสร้างแบบแอคทีฟของ Cas9 นี้สามารถแยกสายดีเอ็นเอเป้าหมายทั้งสองเส้นได้
Chen, Dagdas และ Kleinstiver แสดงให้เห็นว่าโดยการกลายพันธุ์ส่วนต่างๆ ของ REC3 เป็นไปได้ที่จะเปลี่ยนความจำเพาะของโปรตีน Cas9 เพื่อไม่ให้ HNH nuclease ทำงานเว้นแต่ RNA ไกด์และการจับคู่ DNA เป้าหมายจะใกล้เคียงกันมาก พวกเขาสามารถออกแบบ Cas9 ที่มีความแม่นยำสูงมากที่ได้รับการปรับปรุงซึ่งเรียกว่า HypaCas9 ซึ่งยังคงประสิทธิภาพตามเป้าหมาย แต่ดีกว่าเล็กน้อยในการเลือกปฏิบัติระหว่างไซต์ในและนอกเป้าหมายในเซลล์ของมนุษย์
หากคุณกลายพันธุ์กรดอะมิโนบางตัวใน REC3
คุณสามารถปรับสมดุลระหว่างกิจกรรมที่กำหนดเป้าหมายของ Cas9 และความจำเพาะที่ดีขึ้นได้ เราสามารถหาจุดที่น่าสนใจที่มีกิจกรรมเพียงพอที่เป้าหมายที่ตั้งใจไว้ แต่ยังลดกิจกรรมนอกเป้าหมายลงอย่างมาก” เฉินกล่าว
ด้วยการสำรวจความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้าง หน้าที่ และพลวัตของ Cas9 อย่างต่อเนื่อง Doudna และทีมงานของเธอหวังว่าจะสร้างโปรตีนเพิ่มเติมด้วยความไวที่ยอดเยี่ยมเพื่อทำการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมที่หลากหลายได้อย่างน่าเชื่อถือและมีประสิทธิภาพ
ผู้ร่วมเขียนบทความ ได้แก่ Keith Joung ศาสตราจารย์แห่ง Harvard และ Mass General ซึ่งห้องปฏิบัติการได้ออกแบบ Cas9, SpCas9-HF1 ที่มีความเที่ยงตรงสูง Ahmet Yildiz รองศาสตราจารย์ UC Berkeley ด้านอณูชีววิทยาและเซลล์และฟิสิกส์; นักศึกษาระดับบัณฑิตศึกษา Lucas Harrington และอดีต postdoc Samuel Sternberg จาก UC Berkeley; และ Moira Welch และ Alexander Sousa แห่ง Mass General
งานนี้ได้รับการสนับสนุนจากสถาบันสุขภาพแห่งชาติ (GM094522, GM118773, R35 GM118158) และมูลนิธิวิทยาศาสตร์แห่งชาติ (MCB-1617028) เว็บสล็อต
